高效液相色谱法测定黄体酮及有关物质-辽宁化工2022年05期

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导读:摘 要: 本文采用Agilent 1260色谱柱( (250 mm×4.6 mm,5 μm) ),以甲醇-乙腈-水 ( (25:∶35∶:40))为流动相,流速1.0 mL·/min-1,柱温30 ℃,检测波长200 nm,高效液相色谱法测定黄体酮的含量及有关物质,。结果表明,:黄体酮与氢化物、水化物等杂质分离度良好,黄体酮在0.25 ~ 1 200 μg·/mL-1的质量浓度

摘  要: 本文采用Agilent 1260色谱柱( (250 mm×4.6 mm,5 μm) ),以甲醇-乙腈-水 ( (25:∶35∶:40))为流动相,流速1.0 mL·/min-1,柱温30 ℃,检测波长200 nm,高效液相色谱法测定黄体酮的含量及有关物质,。结果表明,:黄体酮与氢化物、水化物等杂质分离度良好,黄体酮在0.25 ~ 1 200 μg·/mL-1的质量浓度范围内呈良好的线性关系((R2 = 0.999 93,n =7)),水解物在0.26 ~ 104 μg/mlμg·mL-1范围内呈良好的线性关系((R2 = 1.000 0,n = 6)),氢化物在 0.26 ~ 105 μg/mlμg·mL-1的质量浓度范围内呈良好的线性关系((R2 =1.000 0,n =6)),各杂质的控制限度均达到定量限。本法专属性强,方法准确、灵敏,操作简便,可作为黄体酮的质量控制方法。

关  键  词:高效液相色谱法;黄体酮;有关物质

中图分类号:TQ460.7+2 文献标识码: A 文章编号: 1004-0935(20202022)0×5-00000730-0×

黄体酮是孕激素类药物 ,生理效应及临床治疗作用广泛 ,应用历史悠久。目前 ,黄体酮在《中国药典》2015年版二部中已有收载 ,高效液相色谱法测定其含量与有关物质的检测波长为241 nm [1,-2]。鉴于黄体酮在生产中的引入的中间体氢化物(5-孕甾烯-3β-醇-20-酮3-醋酸酯)和水化物(5-孕甾  烯-3β-醇-20-酮),在药典条件下不能检测 ,为保证各有关物质快速 准确的测定,本文创建了高效液相色谱法波长200 nm的检测方法,有利于更好的地提高黄体酮质量和生产的稳定性,该方法未见药典收载,也未见文献报道。

1  实验部分

1.1  主要仪器与试药

Agilent 1260 高效液相色谱仪((二极管阵列检测器))。黄体酮对照品(,批号:100027-201209,含量纯度:99.7%)(,中国药品生物制品鉴定所);黄体酮供试品(,批号:HT-p201806001,江苏联环药业有限公司);水解物工作对照品((精制品) )(,批号:l+vgjKfEj72DYjXz+JmgaQ==HT-a20180201批精制品)(,AR,上海青析化工科技有限公司AR  批号20110907);

氢化物工作对照品(中间体)(,批号:20180201)(,国药集团化学试剂有限公司CP  批号T20110324);甲醇,、乙腈(,色谱纯,天津康科德科技有限公司) ,;水为超纯水。

1.2  实验方法

1.2.1  色谱条件

色谱柱为:Kromasill00 - -5 C18 (250 mm×4.6 mm,5 μm);流动相:为甲醇-乙腈 -水 (( 25∶35∶40));柱温30 ℃;流速1.0 mL·/min-1;检测波长200 nm;进样体积10 μL。

1.2.2  标准溶液的配制

取黄体酮对照品约40 mg,,精密称定,置20 mL 容量瓶中,加流动相溶解并稀释至刻度,摇匀,作为黄体酮对照品储备液。精密吸取黄体酮储备液 1.0 mL,置 100 mL 容量瓶中,加流动相溶解并稀释至刻度,摇匀,作为黄体酮对照品溶液。

取水解物工作对照品((精制品))约10 mg,精密称定,置100 mL容量瓶中 ,加稀释液溶解并稀释至刻度,摇匀,作为氢化物工作对照品储备溶液。精密吸取1.0 mL,置 10 mL容量瓶中,加稀释液溶解并稀释至刻度,摇匀,作为水解物工作对照品溶液。

取氢化物工作对照品(中间体)约10 mg,精密称定,置100 mL容量瓶中 加稀释液溶解并稀释至刻度,摇匀,作为氢化物工作对照品储备溶液。精密吸取1.0 mL,置10 mL 容量瓶中,加稀释液溶解并稀释至刻度,,摇匀,作为氢化物工作对照品溶液。

1.2.3 黄体酮碱破坏溶液:

取本品黄体酮对照品约25 mg,精密称定,置25 mL容量瓶中,加0.1 mol·/L-1氢氧化钠甲醇溶液10 mL使溶解,置60 ℃水浴4小时 h,放冷;用1 mol·L-1mol/L盐酸溶液调节至中性,用稀释液稀释至刻度,摇匀。

1.2.4  黄体酮系统适用性溶液:

精密吸取氢化物、水解物工作对照品储备溶液各1.0 mL,置10 mL容量瓶中,加黄体酮碱破坏溶液稀释至刻度,摇匀,作为黄体酮(粗品)系统适用性溶液。

1.2.5  黄体酮试验溶液:

取本品约10 mg,精密称定,置10 mL容量瓶中,加少量稀释液溶解,精密吸取氢化物、水解物工作对照品储备溶液各1.0 mL,加稀释液至刻度,,摇匀,作为黄体酮系统适用性溶液。

2  实验结果

2.1  方法学验证

2.1.1 专属性考察

在1.2.1节色谱条件下进样,记录色谱图如图1,所示,黄体酮主要杂质分离结果如表1所示。黄体酮在241 nm有吸收,而已知杂质在   241 nm无吸收(图1A),在波长200 nm下黄体酮和已知杂质水解物、氢化物以及碱破坏降解杂质有吸收(图1B),)。由表1的结果可以看出,黄体酮和已知杂质水解物、氢化物以及碱破坏降解杂质的均可达到有效分离,表明该法的专属性好,可以有效检测黄体酮生产过程中在各苛刻条件下(碱水解)的降解产物及中间产物。

2.1.2  线性范围

2.1.2.1  黄体酮的线性范围

分别精密量取黄体酮储备液适量,加稀释溶剂稀释制成1 200;、1 000;、500;、100;、50;、20;、10;、5;、2;、1;、0.5;、0.25 μg·/mL-1的溶液,摇匀。按上述色谱系统((1.2.1)),将上述标准溶液依次进样,记录峰面积。以峰面积(A)为纵坐标,、浓度(C,μg·mL-1μg/ml)为横坐标进行线性回归,得线性回归方程及关系。,结果如表2所示。由表2可知,黄体酮(200 nm波长)在0.25 ~ 1 200 μg·mL-1 μg/ml的质量浓度范围内呈良好的线性关系((R2 =为1.0000 000 0和0.999 93,n =7))。

2.1.2.2  有关物质的线性范围

分别精密量取适量水解物对照品储备溶液,加稀释溶剂稀释制成100、50、20、10、5、2、1、0.5、0.25 μg·mL-1的溶液,摇匀。

分别精密量取适量氢化物工作对照品储备溶液,加稀释溶剂稀释制成100、50、20、10、5、2、1、0.5、0.25 μg·mL-1的溶液,摇匀。

按上述色谱系统(1.2.1)将上述标准溶液依次进样,记录峰面积。以峰面积为纵坐标,质量浓度为横坐标进行线性回归,得线性回归方程及相关系数,结果如表2所示。水解物在0.26 ~ 104 μg·mL-1范围内呈良好的线性关系(R2 = 1.000 0,n = 6),氢化物在 0.26 ~ 105 μg·mL-1的质量浓度范围内呈良好的线性关系(R2 =1.000 0,n =6)。

2.1.2.2 有关物质的线性范围

分别精密量取适量水解物对照品储备溶液,加稀释溶剂稀释制成100;50;20;10;5;2;1;0.5;0.25μg/ml的溶液,摇匀。

分别精密量取适量氢化物工作对照品储备溶液,加稀释溶剂稀释制成100;50;20;10;5;2;1;0.5;0.25μg/ml的溶液,摇匀。

按上述色谱系统(1.2.1),将上述标准溶液依次进样,记录峰面积。以峰面积为纵坐标,浓度为横坐标进行线性回归,得线性回归方程及相关系数。结果如表2,水解物在0.26 ~ 104μg/ml范围内呈良好的线性关系(R2 = 1,n = 6),氢化物在 0.26 ~ 105 μg/ml的浓度范围内呈良好的线性关系(R2 =1,n =6)。

2.1.3  定量限与检测限

8XZydBV19Whq7mbMEYqlSA==

黄体酮、水解物、氢化物定量限溶液:精密吸取黄体酮对照品溶液0.4 mL、水解物工作对照品溶液5.0 mL、氢化物工作对照品溶液6.0 mL,置100 mL 容量瓶中,,加稀释液稀释至刻度,,摇匀,作为黄体酮、水解物、氢化物定量限溶液。

黄体酮、水解物、氢化物检测限溶液:精密吸取黄体酮、水解物、氢化物定量限溶液3.0 mL,置10 mL容量瓶中 加稀释液6.0 mL,摇匀,作为黄体酮、水解物、氢化物检测限溶液

按本法测定,精密量取上述定量限溶液、检测限溶液分别进样10 μuL,当信噪比S/N≥10时,作为定量限溶液;当信噪比S/N≥3时,作为检测限溶液;。同时取各定量限溶液连续进样6针,记录色谱图。。结果表3表明:表明,黄体酮、水解物和氢化物的定量限分别为0.040,、0.517,、0.640 μg·mL-1, μg/ml均小于限度质量浓度( 1.0 μg·mL-1 μg/ml),;检测限质量浓度分别为0.013,、0.172,、0.213 μg·mL-1, μg/ml均小于限度质量浓度( 0.5 μgE03Lzb+FUVIOCVtAwczqgA==·mL-1 μg/ml)。

2.1.4  精密度试验

2.1.4.1  重复性

取6份样品溶液检测,黄体酮、水解物含量、氢化物含量,、未知杂质含量的相对标准偏差分别为0.02%,、0,、7.81%,、0.37%,结果表明本方法重复性好。

2.1.4.2  中间精密度

两2位操作人员于两天于2天内分别按1.2.2方法配制6份样品溶液进行分析,记录峰面积。两2位人员于两天于2天内测得的黄体酮、水解物含量、氢化物含量、未知杂质含量的相对标准偏差分别为1.24%,、0,、0.39%,、0.5%,,结果表明方法的中间精密度符合可接受标准。

2.1.5  方法耐用性

固定其它其他色谱条件不变,将上述色谱条件分别改变流速(分别为0.95、1.05 mL·/min-1;1.05ml/min)、改变色谱柱温度(分别为28℃;、32 ℃)后、进样,对水解物,、黄体酮,、碱降解物,、氢化物分离度进行考察,实验结果表明:,在上述色谱条件下,黄体酮与3种杂质的分离度好,3种杂质与黄体酮的相对保留时间(RRT)没有显著变化,各组分的含量基本恒定。因此,色谱条件的细微变化对测定结果没有影响。

2.2  样品测定

按 1.2.2方法分别配制混合对照品溶液和样品溶液,按色谱系统1.2.1色谱条件分别进样分析,按外标法计算黄体酮及各已知杂质的含量,其它其他未知杂质含量按不加校正因子的主成分自身对照法计算。 样品测定结果见表3。

3  讨 论结 论

本文建立了高效液相色谱法200 nm波长下测定黄体酮及有关物质的含量,本方法具有一定专属性、灵敏度、准确性、耐用性,可以作为黄体酮粗品、精制品质量的有效检验、监控。在黄体酮粗品波长200 nm检测试验中,除了已知杂质水解物、氢化物等峰外,还检测出未知杂质峰。杂质分子结构、来源有待进一步分析研究,生产中暂归化法检测监控。

参考文献:

[1]    国家药典委员会. 中华人民共和国药典. (二部)二部[[S].].北京: 中国医药科技出版社, 2015:890.

[2]    高娟 ,唐素芳. 高效液相色谱法测定黄体酮的有关物质[J].中国药品标准 ,2010,,11(1)(1): 29-32.

[3]张立雯 ,冉兰 ,晁若冰. HPLC测定黄体酮中的有关物质[ J] . 华西药学杂志 .,2006 ,21( 6) (6)::570-572.

Determination of Progesterone and Related Substances

by High Performance Liquid Chromatography

CHEN Li-ping ZHOU Hui ZHANG Xin YOU Xin-tian

(School of Chemical Engineering Yangzhou Polytechnic Institute Yangzhou Jiangsu Yangzhou 225127 China)

Abstract:  High performance d18fc2f6dc1d62aa2cf50f8e9027a17d7e63eb03c815fca4339a774984e75ba6liquid chromatography (HPLC) was applied to the determination of e progesterone and related substances. The analysis was carried out on a Agilent 1260 column (250 mm×4.6 mm 5 μm) with methanol-acetonitrile-water (25∶35∶4025:35:40) as mobile phase the flow rate was 1.0 mL·min-1mL/min. The detection wavelength was set at 200 nm with the column temperature of 30 ℃. Under the a3d7b6d0baf8ed4a5d116a63fb224dc3fff39909d5165321ede65b2db08c44335bove chromatographic conditions the separation of progesterone from impurities such as hydride and hydrate were achieved . The linear relationship of the progesterone was in the mass concentration range of 0.25 ~ 1 200 μg·mL-1μg/mL (R2 = 0.999 93 n =7). The linear relationship of the hydrolysate was in the range of 0.26-~104  μg/mLμg·mL-1  (R2 =1.000 0 n =6) and the linear relationship of the hydride was in the range of 0.26-~105 μg/mLμg·mL-1  (R2 =1.000 0 n =6). The method can be used as a quality control method for progesterone.

Key words:  High performance liquid chromatography; Progesterone; Related substances

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